Plasmid plug & play : Plasmide pour le clonage itératif d'un long fragment d'ADN

Challenges

Il existe aujourd'hui un grand nombre de plasmides conçus pour le clonage. La grande majorité de ces plasmides sont des outils hérités d'une équipe de recherche à l'autre et adaptés à une problématique ciblée. Tous sont basés sur l'utilisation d'un Multiple Cloning Site (MCS), composé d'une cinquantaine de sites de restriction enzymatiques uniques, permettant la linéarisation du plasmide.

Cette conception simple est plus que suffisante pour la majorité des clonages unitaires de petits fragments (<10 kb). Cependant, il devient limitatif dès qu'il faut multiplier les étapes de clonage pour de longs fragments d'ADN qui ne peuvent pas être assemblés en une fois ou même pour des projets de recherche successifs nécessitant de retravailler un même plasmide déjà modifié.

En effet, les sites de restriction uniques utilisés pour le clonage sont presque toujours détruits par l'étape d'assemblage. De plus, l'ajout de séquences dans le vecteur de clonage initial est très susceptible d'ajouter des copies surnuméraires des sites de restriction uniques, les rendant inutilisables en raison de la perte de leur spécificité. Cette probabilité augmente avec la taille de la séquence insérée. Par conséquent, la plupart des plasmides ne peuvent être utilisés qu'une ou deux fois pour le clonage,

Solution innovante

Une construction plasmidique « prête à l'emploi » optimisée permettant un clonage itératif,

APPLICATIONS

• Clonage itératif
• Outil de biologie moléculaire
• Long fragment d'ADN
• Système PKS NRPS

AVANTAGES

• Plasmide réutilisable (Eternal MCS)
• Économie de temps et d'argent
• Clonage combinatoire (sans cicatrice)
• Idéal pour les longs fragments d'ADN
• Facile à utiliser, aucune expertise en biologie moléculaire nécessaire
• Plasmide central pratique : shuttle

DÉVELOPPEMENT

POC sur les variantes de la polymyxine

A faire :

• Conception du corps plasmidique
• onception du site de clonage pour les ADN riches en GC et pauvres en GC
• Test sur différents modèles.

Coment ça marche ?

Le plasmide plug and play est un système de clonage classique qui augmente le facteur de réutilisabilité. C'est une combinaison de séquences de sites de restriction qui sont :

• Non détruit lors du clonage simple
• Rare, et donc moins souvent dupliqué lors des étapes de clonage successives
• Organisé de manière à permettre le réassemblage de fragments sans générer de séquences "cicatrices", c'est-à-dire de petites séquences indésirables qui peuvent interférer avec les phénomènes de transcription et de traduction des gènes.

La méthode présentée ici a l'autre avantage d'être basée sur un petit nombre de clonages très détaillés. Cela se traduit notamment par des séquences oligonucléotidiques PCR partiellement conçues pour des assemblages de type Gibson et des protocoles précis concernant les étapes du processus de clonage. Cela garantit à l'utilisateur :

1. Une moindre chance de mauvaise conception du clonage.
2. Grande robustesse sur la plupart des étapes de clonage.